来源：雪球App，作者： 江苏耀海生物CDMO，（https://xueqiu.com/9950954021/294644996）
导读
病毒样颗粒（Virus-like Particles，VLP）是一种独特的生物材料，具有与真实病毒相似的外形和结构，但本质上不含有病毒的遗传物质，如DNA或RNA，因此它们不具备感染能力。由于VLP的这一特性，它们在疫苗研发中显示出了巨大的潜力，尤其是在设计针对乙型肝炎、人类乳头瘤病毒（HPV）以及最新的新型冠状病毒（COVID-19）的疫苗时。
VLPs能够激发免疫系统的响应，因为它们能够被宿主的免疫系统识别为外来物质，从而引发特异性免疫反应，包括产生抗体和细胞介导的免疫反应。这使得VLP成为一种安全且有效的疫苗平台，可以用于预防多种由病毒引起的疾病。
此外，VLPs还可以用作递送系统，将特定的分子或药物递送到体内特定的细胞中。由于VLPs能够模仿病毒的进入途径，它们可以用来研究病毒的生命周期，以及开发新的抗病毒治疗方法。
近年来，VLP技术在预防医学领域迅猛发展，成功推动了多种针对不同传染性疾病的高度有效疫苗候选物的研发，显著增强了疫苗领域的预防潜力。
1. VLP疫苗发展进程
VLP作为高度结构化的蛋白质颗粒，其颗粒结构有利于抗原呈递细胞的摄取，可以激发宿主先天和适应性免疫反应功能。在过去的三十年中，VLP应用逐渐广泛，尤其在疫苗领域。一些基于VLP的疫苗已经用于商业化生产，或者已进入临床研究的不同阶段（图1）。乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）VLP是第一个获得批准的基于VLP的疫苗，其次人类乳头状瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）VLP和戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）VLP相继被批准[1]，2021年，疟疾疫苗被批准上市。除此之外，诺瓦克病毒VLP疫苗和流感病毒VLP疫苗正在进行临床试验，丙型肝炎病毒VLP疫苗和登革病毒VLP疫苗正在处于临床前试验阶段。同时，基于VLP的动物病毒也在不断开发，如猪细小病毒VLP疫苗等。
图1 目前批准的基于VLP的疫苗的发展
2. VLP的多样性
2.1
结构多样化
VLP的结构多样性使它们在功能上用途广泛。VLP分为非包膜病毒颗粒和包膜病毒颗粒（图2）。非包膜VLP可分为单衣壳蛋白VLP和多衣壳蛋白VLP。单衣壳VLP由单个衣壳蛋白组成，可以在原核和真核表达系统中产生，例如获得许可的HPV VLP疫苗。而多衣壳蛋白VLP的生产更加复杂，通过不同衣壳蛋白在真核表达系统中的共同表达或者在细胞内的进行复杂组装产生。包膜VLP结构相对非包膜VLP复杂，只能在真核表达系统。包膜VLP以矩阵形式包裹在来源于宿主的含有糖蛋白的脂膜中，这些糖蛋白可以产生中和抗体的靶标免疫抗原，此类VLP结构复杂，构建难度大。
图2 VLP的结构多样化
2.2
功能多样化
VLP的功能多样化主要是由于结构的可设计性和修饰性[2]。首先，VLP分子具有高度均匀、规则的形状。特别是对于复杂的VLP，可能被用于合并多个大型表位，这些表位可以合理地设计用于多功能目的。但是，掺入多个大表位可能会破坏VLP的自组装。其次，在VLP的构建中，VLP可以很容易地在外表面或内表面用分子进行遗传或化学修饰，以调节其免疫原性和化学性质。最后，天然病毒中，蛋白质衣壳的作用是包含和保护遗传物质，以便感染到宿主细胞中。类似的原理，一些病毒衣壳蛋白的特性允许VLP封装蛋白质、分子或核酸。这些VLP充当递送容器，旨在通过靶向VLP表面的抗体或细胞特异性配体将其输送到特定的细胞，组织或器官。
图4 VLP的合成及修饰策略
3. VLP的作用机制
因具有良好的免疫原性以及较高的安全性逐渐成为当今药物及疫苗研究的热点。研究显示，VLP的作用机制主要与免疫刺激相关。首先，VLP天然病毒具有相似构象的抗原，VLP表面抗原可以通过交联多个B细胞受体来增强B细胞的活化[3]。其次，VLP被树突状细胞经吞噬、渗透等机制摄取，内化的VLP由主要组织相容性复合物（Major Histocompatibility Complex，MHC）II处理和呈递，用于激活辅助性T细胞（图3）。最后，由于VLP高度有序的结构，可以被特异性受体识别，并增加MHC I类抗原呈递，从而引发T淋巴细胞毒性[4]。
图3 VLP的免疫刺激
4. VLP表达平台
包括原核生物和真核生物系统在内的各种表达平台都可用于生产VLP，例如酵母、杆状病毒/昆虫细胞系统、哺乳动物细胞和植物系统（表1）。此外，无细胞表达系统也已成功应用在VLP的表达上[5]。
表1 VLP表达系统对比
4.1
细菌
细菌是最广泛使用的表达系统之一，由于二硫键形成不完全和蛋白质溶解度问题等各种因素，因此不适合生产包膜VLP，但可用于生产具有一种或两种病毒结构蛋白的非包膜VLP。大肠杆菌是VLP生产中最常见的细菌宿主细胞，生产成本低、细胞生长快、蛋白表达水平高和易于放大，使用大肠杆菌表达系统生成的各种VLP疫苗已进入临床试验。除大肠杆菌外，在其他细菌中也观察到VLP的成功形成，例如：干酪乳杆菌、荧光假单胞菌等。
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4.2
酵母
酵母常用于重组蛋白表达，也用于VLP的生产，通常用于生成无包膜VLP。尤其是酿酒酵母和毕赤酵母，因其细胞生长快、表达蛋白产量高、可扩展性、以及一定程度的翻译后修饰（Post-translational Modifications，PTM）等优点而受到青睐。现今，经FDA批准的两种基于VLPs的疫苗，Engerix-B（HBV疫苗）和Gardasil（HPV疫苗）都已经在酵母表达系统中产生。但缺乏复杂的PTM途径是酵母表达系统的一个主要缺点，这限制了它们在VLP生产中的应用。
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4.3
杆状病毒/昆虫细胞
杆状病毒/昆虫细胞表达系统是生产VLP最常用的表达系统。基于杆状病毒的VLP表达迅速而便捷，因此该系统适用于生产快速改变其表面抗原的病毒疫苗（如流感病毒疫苗）。昆虫细胞表达系统具有多种优势，例如表达蛋白的产量高，存在复杂的PTM通路和多蛋白VLP的形成等，常用的昆虫细胞系包括Sf9细胞、Sf21细胞、Tn-368细胞和 High Five细胞。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的主要潜在缺点是，与哺乳动物细胞相比，表达的糖蛋白的N-糖基化模式更简单，这对于某些VLP应用来说可能是一个缺点。如果昆虫细胞糖基化模式得到改善，杆状病毒/昆虫细胞系统可能是基于VLP疫苗生产中最佳的表达系统。
4.4
植物细胞
与传统方法相比，植物表达系统具有高蛋白表达水平、低成本和高性能表达处理等优势。因此，植物表达系统目前是生产不同药用蛋白质（包括疫苗）的具有成本效益和可扩展的替代方案。已有超过55种不同的植物病毒已被用于构建抗原表达平台，包括烟草花叶病毒、苜蓿花叶病毒、豇豆花叶病毒和木瓜花叶病毒等。其中，最有效的植物表达系统之一是基于农杆菌介导的烟草花叶病毒表达载体。
4.5
哺乳动物和鸟类细胞
动物细胞表达系统是最有价值和有吸引力的平台，可用于生产无包膜VLP和包膜VLP的多种结构蛋白。动物细胞表达系统是VLP生产最有效的系统，因为它们能够制造复杂而精确的PTM，这对于正确的蛋白质折叠至关重要。目前，多种动物细胞系被广泛用于生产VLP，包括CHO、BHK-21、HEK293和CAP-T等。其中，CHO是最常用的细胞系，它不来自于人类细胞，被人类病毒污染的风险较低。HEK293已被广泛用于生产对抗HIV、流感和狂犬病病毒的VLP，CAP-T细胞系也被证明是HIV VLPs生产的高效表达系统。然而，动物细胞表达系统也存在一定的缺陷，低蛋白产量、高生产成本、长表达时间以及细胞系携带哺乳动物病原体感染的可能性都是主要潜在缺点。
4.6
无细胞系统
无细胞系统为体外表达重组蛋白的VLP生产提供了另一种选择，这些系统通常由细菌或酵母细胞组成，用于合成病毒衣壳蛋白。与基于细胞的蛋白质表达平台相比，无细胞系统节省时间、蛋白质产量高、细胞污染物有限以及可选择生成含有非天然氨基酸或有毒蛋白质中间体的VLP。然而，无细胞系统生产成本较高，在商业应用方面存在显著局限性。
5. VLP的优化
尽管VLP表达平台在过去已经建立和优化，但生物效力仍然不足以满足未来的需求。为了解决这些局限性，已对VLP的优化做出了许多努力。例如，通过细胞培养基优化、细胞系工程、使用合理的设计方法（实验设计）和修改培养基组成等（图5）。除此之外，还有一种更复杂的方法，使用基于约束的建模进行过程优化。研究表明，为了更好地了解上游过程，关键方法是基于约束的建模，其核心是基因组代谢网络。基因组代谢网络是细胞新陈代谢的数学表示，可以捕获所有代谢转化过程的化学计量。基于此，可以开发大量的代谢模型，用于克服生物工艺优化中的各种挑战，包括培养基优化或工程目标识别。因此，基于计算机模拟工具，通过分析宿主细胞内的代谢通量分布来优化培养基组成，然后应用这些知识来减少副产物的积累，同时提高细胞生产力[7]。
图5 生物过程优化策略
结语
基于VLP设计的疫苗被认为既可以引起抵抗多种抗原的强烈的体液免疫和细胞免疫，同时相比传统疫苗更加安全，并且由于其与亲本病毒的大小和形态相似等诸多特点，在过去的几年里，VLP已经发展成为一种被广泛应用的生物技术。同时VLP结构的多样性和功能的多功能性提供了快速发展的研究潜力，强大而灵活的生产平台为该领域开辟了广泛的可能性。随着VLP技术的最新发展，其在疫苗生产、疫苗制备工艺方面所展现的优势为新型疫苗的研制提供了重要的研究平台和广阔的应用前景。
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参考文献[1] Lua LH, Connors NK, Sainsbury F, Chuan YP, Wibowo N, Middelberg AP. Bioengineering virus-like particles as vaccines. Biotechnol Bioeng. 2014 Mar;111(3):425-40.
[2] Ding X, Liu D, Booth G, Gao W, Lu Y. Virus-Like Particle Engineering: From Rational Design to Versatile Applications. Biotechnol J. 2018 May;13(5): e1700324.\
[3] Zepeda-Cervantes J, Ramírez-Jarquín JO, Vaca L. Interaction Between Virus-Like Particles (VLPs) and Pattern Recognition Receptors (PRRs) From Dendritic Cells (DCs): Toward Better Engineering of VLPs. Front Immunol. 2020 Jun; 11:1100.
[4] Mellid-Carballal R, Gutierrez-Gutierrez S, Rivas C, Garcia-Fuentes M. Viral protein-based nanoparticles (part 2): Pharmaceutical applications. Eur J Pharm Sci. 2023 Oct 1; 189:106558.
[5] Cervera L, Gòdia F, Tarrés-Freixas F, Aguilar-Gurrieri C, Carrillo J, Blanco J, Gutiérrez-Granados S. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Appl Microbiol Biotechnol. 2019 Sep;103(18):7367-7384.
[6] Zeltins A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 2013 Jan;53(1):92-107.
[7] Zehetner L, Széliová D, Kraus B, Graninger M, Zanghellini J, Hernandez Bort JA. Optimizing VLP production in gene therapy: Opportunities and challenges for in silico modeling. Biotechnol J. 2023 Jul;18(7): e2200636.
